詳細情報 |
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猫。いいえ。: | R1011/R1012 | 集中: | R1011 (20のrxns)、R1012 (100つのrxns) |
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出現: | 無色 | グループ: | 逆のTranscriptase PCRの試薬 |
活動: | パス | 拡大の機能: | / |
ロゴの印刷: | ロゴの印刷を使って | 輸送のパッケージ: | パッキング |
生産能力: | 1日あたりの100箱の箱/箱 | 貯蔵条件: | -20°Cの店 |
ハイライト: | 20のrxnsの逆のTranscriptase PCRの試薬,100つのrxnsの逆のTranscriptase PCRの試薬,20のrxnsの最初繊維のcdnaの統合のキット |
製品の説明
RT - PCRのキット
研究の使用だけのため
猫NO R1011の20のrxns
猫NO R1012の100つのrxns
キットの部品
部品 | R1011 (20のrxns) | R1012 (100つのrxns) |
M-MLV (200U/μl) | 20 μl | 100 μl |
RNasin (40U/μl) | 12 μl | 60 μl |
Oligo (dT) 15 (50μM) | 20 μl | 100 μl |
任意hexamerのプライマー(50μM) | 20 μl | 100 μl |
5×最初の繊維の緩衝 | 80 μl | 400 μl |
RNaseなしのddH2 O | 1つのml | × 1つのmlの5 |
dNTPs (10mMそれぞれ) | 50 μl | 250 μl |
貯蔵
キットの全部品は長期保管のための-70°Cで-20°C.で保つ制御RNAを貯えられるべきである。
記述
RT-PCRのキットは浄化された多からの最初の繊維のcDNAを総合するために最大限に活用される(A)+か総RNA。RT-PCRのためのRT-PCRのキットは便利なフォーマットの増加されたcDNAの収穫、高い感受性および実物大のコピーを提供する。あなたが巧妙な最初の繊維のcDNAの統合のために必要とする部品すべてを得、あなたの時間を節約しおよびあらゆる実験のあなたの成功を保障する。キット逆のTranscriptaseはRNase Hの活動を減らし、高められた熱安定性を提供するために設計されたM-MLV RTの版である。酵素がcDNAの高められた特定性総合するのに、高い収穫、および他の逆のtranscriptasesより実物大プロダクトを提供する42-55°Cの温度較差でcDNAを使用されている。
適用
RT-PCRのための最初繊維のcDNAの統合
cDNAの図書館の構造
ワン・ステップRT-PCR
プライマー延長
要注意事項
リボヌクレアーゼの汚染の回避
RNAの純度および完全性は実物大のcDNAの統合のために必要である。RNAはあらゆる実験室の環境で見つけられる非常に安定した汚染物であるRNase Aによって低下させることができる。キットの全部品は厳格にRNaseなしであることを保障するためにテストされた。汚染を防いで実験室の環境および試薬は両方、すべての準備された解決RNasesの自由でなければならない。RNaseの汚染を避ける概要の推薦:
- DEPC御馳走cDNAの統合で使用されるか、または証明されたヌクレアーゼなしのlabwareを使用するすべての管およびピペットの先端。
- 皮がRNasesの共通のソースであるのでRNAおよびすべての試薬を扱った場合手袋を身に着けなさい。頻繁の変更の手袋。
- 良質水(例えば、DEPC扱われた水)を含むRNaseなしの試薬を、使用しなさい。
- RNasesの活動からRNAを保護するのにDongsheng RNasin (#R2011)のようなRNaseの抑制剤を、使用しなさい。
- 使用中場合のすべてのキットの部品を堅く密封しておきなさい。すべての管を堅く閉まった逆のトランスクリプション反作用の間に保ちなさい。
型板のRNA
標準的な方法で隔離される総細胞RNAはキットとの使用のために適している。浄化されたRNAはcDNAの統合の反作用を禁じることを避けるべき塩、金属イオン、エタノールおよびフェノールの自由でなければならない。跡の汚染物は冷たい75%のエタノールと餌の2洗浄に先行しているRNAのエタノールの沈殿物によって取除くことができる。RT-PCRの適用のために、型板のRNAはDNAの汚染の自由でなければならない。cDNAの統合前にDNAの微量を取除くために、RNAはDNase Iと扱うことができる。DNase私はユーザーによって得られなければならない。逆のtranscriptaseの酵素を除いてRT-PCRのための全部品を含んでいる制御(RT引いて)反作用を常に行いなさい。
RNase Hの消化力
PCRのステップの感受性はcDNAからRNAの型板を取除くことによって(特に長い型板のために)高めることができる:最初の繊維の統合の後のRNase Hとの消化力によるRNAの雑種の分子。最初の繊維の統合の間のRNase Hの存在は最初の繊維のcDNAの減らされた実物大のcDNAの統合そして減らされた収穫に終って型板mRNAを、低下させる。
プライマー
最初繊維のcDNAの統合はoligo (dT) 15プライマー、任意プライマーまたは遺伝子特定のプライマーによって発動を促すことができる。
Oligo (dT) 15は多からのcDNAの統合の発動を促す(A) 3時の尾現在- eukaryotic mRNAの端。任意プライマーは総RNAの人口からのcDNAの統合を始める(rRNAおよびmRNA)。従って、oligo (dT) 15プライマーによって比較される発生させたcDNAのより大きい複雑さの最初繊維の統合の結果のための任意プライマーを使用して。結果として、それに続くPCRの反作用の感受性そして特定性は減るかもしれない。但し、任意プライマーを使用することは有利のcDNAの統合のような複数の適用が多なしにmRNAsを使用してある(A)多(A) -富ませたRNAのサンプルを使用して尾、かcDNAの統合。
遺伝子特定のプライマーが総RNAまたはmRNAのプールからの特定のcDNAを総合するのに使用され、ユーザーによって得られなければならない。
最初の繊維のcDNAの合成手順
最初の繊維のcDNAの反作用は異なったRNAの型板と個々の反作用または一連の平行反作用として行うことができる。従って、反応混合物は試薬をそれぞれ結合することによって準備することができるまたは型板のRNAを除く部品すべてを含んでいるマスターの組合せは準備することができる。RNAの型板の構造によって、RNAの変性のための別のステップおよびプライマー アニーリングはRT-PCRの結果を改善するかもしれない。
議定書
I.最初繊維のcDNAの統合
1. 示された順序で氷の生殖不能の、ヌクレアーゼなしの管に次の試薬を加えなさい:
型板のRNA |
多(A) mRNA または特定のRNA |
1-5 μg |
プライマー |
oligo (dT) 15プライマー または任意hexamerのプライマー |
1つのμl 1つのμl |
DEPC扱われた水 | 12.4のμlに | |
総容積 | 12.4のμl |
2. 穏やかに混合し、簡潔に遠心分離機にかけ、そして氷の冷え5 min.のの70°Cで、回り、ガラスびんを氷に置くために孵化させなさい。
3. 次のcDNAの統合の組合せを準備しなさい、示された順序で次の部品を加えなさい:
5×最初の繊維の緩衝 | 4 μl |
dNTPs (10のmMそれぞれ) | 1つのμl |
RNasin | 0.6のμl |
M-MLV | 1つのμl |
4. 穏やかに混合し、簡潔に遠心分離機にかけなさい。
5. oligo (dT) 15のために、42°C.で60分の間孵化させなさい。任意hexamerのために発動を促された統合は37°C.で60分の間、孵化する。
6. 5 min.の70°Cで熱することによって反作用を終えなさい。
逆のトランスクリプション反作用プロダクトは第2繊維のcDNAの統合の反作用ですぐに使用されるか、または-20°Cで週以内のために貯えることができる。長期保管のために、-70°Cは推薦される。
II.最初繊維のcDNAのPCRの拡大
最初の繊維のcDNAの統合のプロダクトはPCRかqPCRで直接使用することができる。最初繊維のcDNAの統合の反応混合物の容積は総PCRの反作用の容積の以上1/10構成するべきではない。通常、最初の繊維のcDNAの統合の反応混合物の2 μlは50のμlの総容積でそれに続くPCRのために型板として使用される。
DongshengバイオテクノロジーはPCRの成功を達成するのを助けるように異なった一連のプロダクトを提供する。酵素のために、Taqの私達のポリメラーゼ、HS TaqのDNAポリメラーゼ、FS TaqのDNAポリメラーゼ、PfuのDNAポリメラーゼおよび融合のPfuのDNAポリメラーゼはハイ ファイを、有効、感受性PCRの性能提供する。私達にまた長いPCRの性能のための長いTaqのDNAポリメラーゼがある。